定义：
酶联免疫吸附测定（简写ELISA）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上 ，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。
常用的ELISA可以分为五大类：直接ELISA、间接ELISA、夹心ELISA、竞争ELISA、竞争抑制ELISA。其他的ELISA都由这五类组合衍生。
所有的ELISA基本由基础的几个步骤组合而成：将抗原或抗体吸附到固相载体上；加入待检样品以及后续试剂；温育；洗涤去掉游离未结合的反应物；加入酶检测底物；结果的判读
分类：
1.直接ELISA
将抗原按一定的比例稀释 ，包被到固相载体上 ，加入稀释好的特异性的酶标抗体 ，孵育后加入底物显色并判读结果。直接ELISA中只经过了一步信号放大 ，所以其灵敏度不是很高
2.间接ELISA
间接ELISA与直接ELISA不同的是 ，与包被好的抗原结合的是非酶标抗体 ，另外再引入第二种抗体（即二抗）。二抗是经过酶标的 ，它可以与第一种抗体特异性结合 ，最后加入底物显色并判读结果。在检测抗体的效价、血清的效价以及单克隆抗体的筛选过程中 ，间接ELISA都是非常重要的实验过程。
3.夹心ELISA
3.1直接夹心ELISA
3.1.1双抗体夹心ELISA
将第一种抗体（捕获抗体）包被在固相载体上 ，封闭后加入待检抗原 ，温育后加入第二种抗体（检测抗体） ，捕获抗体和检测抗体可以是针对不同表位的两种单抗 ，也可以是针对同一抗原的一种单抗与一种多抗 ，但是检测抗体需要经过酶标。
3.1.2双抗原夹心ELISA
原理和操作与双抗体夹心ELISA基本相同 ，不同的是包被的是抗原 ，待检对象是抗体 ，然后加入酶标抗原 ，再加底物显色。双抗原夹心ELISA利用特异性的抗原代替酶标二抗 ，所以特异性比间接法更好。另外 ，由于间接ELISA中使用的二抗一般只能识别IgG ，而双抗原夹心ELISA中任何类似的免疫球蛋白都可以被检测出 ，因此 ，双抗原夹心ELISA比间接ELISA也更灵敏。
3.2间接夹心ELISA
间接夹心ELISA是基于两种不同种属来源的抗体的夹心ELISA ，其原理是将一种种属来源的特异性抗体包被于固相载体上（作为捕获抗体） ，封闭 ，加入待检抗原 ，温育 ，洗涤后加入另一种种属来源的特异性抗体（非酶标 ，作为检测抗体） ，最后加入酶标二抗（特异性识别检测抗体） ，再加底物显色。与直接双抗夹心ELISA相比 ，其中引入了特异性识别检测抗体的酶标二抗 ，相当于整个体系的信号增加了一步放大系统 ，最终的结果比直接双抗夹心ELISA更灵敏。
4.竞争ELISA
将特异性抗体吸附于固相载体表面 ，经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液；而另一组只加酶标记抗原 ，再经孵育洗涤后加底物显色 ，这两组底物降解量之差 ，即为所要测定的未知抗原的量。这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位即可 ，因此 ，对小分子抗原如激素和药物之类的测定常用此法。
5.竞争抑制ELISA
预先将抗原包被在固相载体上 ，实验时加入稀释好的待检抗原（或抗体） ，然后依次加入特异性的抗体以及此抗体对应的酶标二抗。待检标本中的抗原（或抗体）就和预制备体系中固相载体上结合的抗原（或抗体）竞争结合特异性的抗体（或固相载体上结合的抗原）。洗掉被竞争的特异性抗体 ，最后加底物显色。最终显色的结果与待检抗原（或抗体）量呈反比。
实验材料：
96孔高吸附酶标板[NEST]
10μL/200μL/1000μL吸头[NEST]
单通道移液枪、多通道移液枪
微量离心管[NEST]
显色液（A/B液）
15/50ml离心管[NEST]
洗液（PBST）
终止液（H2SO4）
BSA蛋白
稀释液（PBS）
包被液（CB）
全波段酶标仪
恒温箱
实验流程：
以使用比较广泛的间接ELISA为例 ，简述实验过程
1.抗原包被：
将对应抗原用CB稀释至1ug/ml ，加入96孔酶标板孔中 ，每孔100ul ，4℃包被过夜 ，之后进行下一步骤。若实验时间比较紧张 ，包被后可放置恒温箱内 ，37℃包被3h后即可进行下一步操作。
2.洗板：
将酶标板内的包被液甩干 ，用洗液（PBST——0.2%的吐温20 PBS）清洗酶标板2次 ，并拍干板内液体 ，使之无余液残留。
3.封闭：
用PBS充分溶解BSA蛋白制备成封闭液（体积比为5~10%） ，将封闭液加入酶标板孔中 ，每孔150ul ，恒温箱37℃封闭1h。若实验时间安排充裕 ，可在4℃条件下封闭过夜。
【若抗原内含有偶联BSA分子 ，则更换封闭成分 ，可用羊血清代替】
4.洗板：
将酶标板内的封闭液液甩干 ，用洗液（PBST）清洗酶标板2次 ，并拍干板内液体 ，使之无余液残留。
【若暂无使用需求 ，可将包被后的酶标板放置-20℃条件下储存 ，需要时解冻使用即可。】
5.一抗：
用PBS稀释液将待检样品（含有对应抗原的抗体）按需求稀释 ，再将稀释后样本加入包被好的酶标板中 ，每孔100ul ，阴性对照孔加入100ulPBS稀释液 ，在恒温箱中37℃孵育1h。
6.洗板：
将酶标板内的一抗甩干 ，用洗液（PBST）清洗酶标板3次 ，并拍干板内液体 ，使之无余液残留。
7.二抗：
用PBS稀释液按照说明 ，稀释对应的酶标二抗 ，将稀释完成的二抗加入一抗孵育完成的酶标板中 ，每孔100ul ，恒温箱37℃孵育30min。
8.洗板：
将酶标板内的二抗甩干 ，用洗液（PBST）清洗酶标板4次 ，并拍干板内液体 ，使之无余液残留。
9.显色：
将显色液A/B液等体积混合 ，配置成显色液 ，加入二抗孵育完成的酶标板中 ，每孔100ul ，恒温箱避光37℃反应5~10min。
【显色液现配现用 ，不可提前配置】
10.终止与读数：
显色完成后 ，无须丢弃显色液 ，直接加入终止液（H2SO4）终止反应 ，每孔50ul ，随即转移至全波段酶标仪450nm单波长度数 ，或450nm/620nm双波长读数 ，读书完成后处理数据。
使用到的NEST产品：
96孔高吸附酶标板[NEST]
10μL/200μL/1000μL吸头[NEST]
微量离心管[NEST]
15/50ml离心管[NEST]
