实验材料：
基础培养基
血清（常规为FBS/NBS）
无菌PBS磷酸盐缓冲液
电动移液枪
移液枪
超净工作台
无菌二甲基亚砜（DMSO）
针式滤器 (0.22μm PES膜) [NEST]
杯式滤器(0.22μm PES膜) [NEST]
15mL、50mL无菌离心管[NEST]
程序降温盒[NEST]
PET/PETG方形试剂瓶[NEST]
移液管[NEST]
自动旋盖机[NEST]
盒装无菌吸头[NEST]
实验准备：
冻存液准备：
一般的细胞：55%基础培养基+40%牛血清（FBS/NBS）+5%DMSO
重要的细胞：90%牛血清（FBS/NBS）+10%DMSO
冻存液配置完成后 ，15ml离心管分装 ，4℃条件下储存备用。若配置量较大 ，可分装入50ml离心管 ，-20℃条件下冷冻储存。（若牛血清内存在析出沉淀物 ，采用0.22μm 滤膜过滤除菌）
使用前37℃水浴加热
待冻存细胞：
使细胞冻存前 ，选择细胞生长状态良好 ，且处于对数生长期的细胞 ，冻存前12~24h换新鲜培养基维持细胞状态。
实验流程：
观察待冻存细胞密度 ，约为80%~90%。用移液枪吸出陈旧培养基 ，加入无菌PBS清洗细胞1-2次 ，去除培养环境中的残留培养基。
加入适量对应胰酶或消化液 ，使胰酶没过细胞 ，放入培养箱消化。显微镜下观察细胞状态 ，胞质回缩 ，细胞间不再连接成片 ，此时加入完终止液终止消化。
用吸头轻轻吹打细胞 ，形成细胞悬液 ，将细胞悬液1000rpm ，离心3-5min。丢弃上清 ，加入适量预先配制好的冻存液 ，轻轻吹打使细胞均匀并计数。用冻存液调节的细胞密度 ，使之终密度为5×106/ml～1×107/ml。
用移液枪按照预计容量 ，分装入细胞冻存管[NEST]中 ，采用自动旋盖机[NEST]旋盖密封。
标准的冻存程序为降温速率况处-1℃～-2℃/ min ，可将待冻存细胞按照以下步骤逐步冻存：室温→4℃（20min）→-20℃（30min）→-80℃（过夜）→液氮长期保存。
也可将待冻存放入程序降温盒[NEST] ，直接-80℃过夜 ，再转移至液氮保存。
使用到的NEST产品：
无菌二甲基亚砜（DMSO）
针式滤器 (0.22μm PES膜) [NEST]
杯式滤器(0.22μm PES膜) [NEST]
15mL、50mL无菌离心管[NEST]
程序降温盒[NEST]
PET/PETG方形试剂瓶[NEST]
移液管[NEST]
自动旋盖机[NEST]
盒装无菌吸头[NEST]
