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PBMC（peripheral blood mononuclear cell），外周血单个核细胞，其主要细胞类型为血液里具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞（Ｔ＼Ｂ），单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型，其中淋巴细胞占很大一部分。分离ＰＢＭＣ的主要目的是为了将多核细胞和红细胞去除，从而能够很方便地模拟体外的血液免疫环境。从血液制备PBMC是分离特定免疫细胞亚群之前常见的一个步骤。最常用的PBMC分选方法是使用密度梯度离心液进行离心。

工具/原料

• 全血 （以10ml为例）
• 无菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理盐水
• 蔗糖溶液（Ficoll Pague PLUS)
• • 外周血淋巴细胞分离管
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方法/步骤

1.  将分离液用移液管从分离管嵌套的中心孔中加入：15ml的分离管需要加入约4ml分离液；50ml的分离管需要加入约13ml分离液，确保分离液覆盖嵌套上方。

2.  将抗凝样本沿管壁缓慢倒入或用移液管沿管壁缓慢加入到分离管中。

3.  室温下离心10min，离心力为1200 x g。

4.  收获PBMC细胞，将分离管中上清倒入另一干净离心管中，分离管中的嵌套能有效避免红细胞和粒细胞再次污染。（注意：离心后倾倒收获细胞前，也可先吸取采集或丢弃最上层血浆层，有助于减少细胞被血小板污染。）

5.  用PBS洗涤PBMC细胞，在250 x g离心力下离心10min。

6.  按步骤5重复洗涤2次，用5ml PBS缓冲液重悬细胞。

离心后液体分离情况（从上到下）：a血浆层；b富集的细胞部分（PBMCs）；c分离液；d嵌套；e沉淀（红细胞和粒细胞）。

注意事项

1.  可用于人类外周血、骨髓和脐带血样本。不适用于血凝等异常样本或超过48小时的样本。

2.  15ml的分离管建议使用4-9ml样本；50ml的分离管建议使用13-30ml样本。

3.  对于放置24h以上的样本，建议离心时间加长。

4.  离心后收获细胞前，也可先吸取采集或丢弃最上层血浆层，有助于防止被血小板污染。

5.  离心后倾倒上清时不要将分离管倒置2s以上。

6.  分离管请勿重复使用。

7.  离心后，细胞可能聚集在富集层以上的分离管的管壁上。这种聚合是正常的，受样本质量、样本放置时间和抗凝剂类型的影响。此聚合与分离管的使用无关。细胞可以通过使用移液管尖端轻刮聚集团的一侧来清除。